大鼠磷酸化cAMP反應元件結合蛋白pCREBELISA試劑盒檢測原理

大鼠磷酸化cAMP反應元件結合蛋白pCREB ELISA試劑盒

檢測原理

　　試劑盒采用雙kang體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。往預先包被磷酸化cAMP反應元件結合蛋白（pCREB）kang體的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測kang體，經(jīng)過溫育并洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的磷酸化cAMP反應元件結合蛋白（pCREB）呈正相關。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度。

　　樣品收集、處理及保存方法

　　1. 血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細胞刺激，收集血液后，3000轉離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。

　　2. 血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉離心30分鐘取上清。

　　3. 細胞上清液：3000轉離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

　　4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉離心10分鐘取上清。

　　5. 保存：如果樣本收集后不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

　　自備物品

　　1. 酶標儀（450nm）

　　2. 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

　　3. 37℃恒溫箱

　　操作注意事項

　　1. 試劑盒保存在2-8℃，使用前室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會有結晶，這屬于正常現(xiàn)象，水浴加熱使結溶解后再使用。

　　2. 實驗中不用的板條應立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。

　　3. 濃度為0的S0號標準品即可視為陰性對照或者空白；按照說明書操作時樣本已經(jīng)稀釋5倍，最終結果乘以5才是樣本實際濃度。

　　4. 嚴格按照說明書中標明的時間、加液量及順序進行溫育操作。

　　5. 所有液體組分使用前充分搖勻。

　　試劑盒組成

　　注：標準品（S0-S5）濃度依次為：0、3、6、12、24、48 ng/mL

　　試劑的準備

　　20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水。

　　洗板方法

　　1. 手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，靜置1min后甩盡孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干，如此洗板5次。

　　2. 自動洗板機：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5次。

　　操作步驟

　　1. 從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

　　2. 設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；

　　3. 樣本孔先加待測樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL；空白孔不加。

　　4. 除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測kang體100μL，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

　　5. 棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次（也可用洗板機洗板）。

　　6. 每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

　　7. 每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值。

　　結果判斷

　　繪制標準曲線：在Excel工作表中，以標準品濃度作橫坐標，對應OD值作縱坐標，繪制出標準品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣本濃度值。

　　試劑盒性能

　　1. 準確性：標準品線性回歸與預期濃度相關系數(shù)R值，大于等于0.9900。

　　2. 靈敏度：zui低檢測濃度小于1.0 ng/mL。

　　3. 特異性：不與其它可溶性結構類似物交叉反應。

　　4. 重復性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于15%。

　　5. 貯藏：2-8℃，避光防潮保存。

　　6. 有效期：6個月

　　免責聲明

　　1. 試劑盒僅供研究使用，不得用于臨床實驗或人體實驗，否則所產(chǎn)生的一切后果，由實驗者承擔，本公司概不負責。

　　2. 嚴格按照說明書操作，實驗者違反說明書操作，后果由實驗者承擔。